猪流行性泻肚(Porcine epidemic diarrhea伪娘 拳交，PED) 是由猪流行性泻肚病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 引起的一种严重的肠谈疾病，主要领路为仔猪出现吐逆、脱水、水样泻肚和高去世率[1-2]。PEDV S卵白是一类位于病毒名义的糖卵白，在入侵宿主细胞、病毒毒力和指引中庸抗体等方面领路紧要作用，凭据功能不同可将S卵白分为S1和S2[3]。在感染PEDV的猪体内，由于S卵白具有较强的抗原性，血清中针对S卵白的抗体比N卵白的抗体抓续时候更长[4]。因此，S卵白是建立会诊门径和研发疫苗的靶卵白。

由于引起猪泻肚的病原大要诱发猪产生相似的临床症状，因此凭据临床症状无法准确会诊PED，只可借助实验室会诊期间[5-6]。现在，已有多种门径用于PEDV的检测，主要分为两大类：病原学检测(核酸和病毒卵白) 和血清学检测。血清学检测门径每每包括波折免疫荧光、病毒中庸纯熟和酶联免疫吸附纯熟(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，这些门径已被庸俗用于检测粪便和血清中的PEDV抗体[7-9]。ELISA由于其机灵度、方便性和安全性等上风而被庸俗应用。检测PEDV抗体常用ELISA门径包括波折ELISA、竞争ELISA和阻断ELSIA，且后两种门径具有更强的特异性[9-10]。

抗体是ELISA的中枢试剂，它决定了ELISA门径检测的机灵性和特异性，现在大多数ELISA试剂盒使用多克隆抗体或者单克隆抗体看成监测试剂，但这些抗体坐蓐工艺烦琐、价钱崇高和储存艰巨[9， 11-12]。因此，进军需要开拓易于坐蓐且坐蓐资本低的抗体用于ELISA门径的建立。与通例抗体不同，纳米抗体，又称单域抗体，是来自骆驼科动物或者软骨鱼类的重链抗体，仅有一个重链可变区结构域，分子量小，惟有约15 kDa [13]。纳米抗体具有高超的热舒适性、构象舒适性和高超的熔解性，且易在多种抒发系统进行坐蓐[14]。基于这些上风，纳米抗体受到越来越多的眷注，有望被用于生物会诊和疫病诊疗中[15-16]。2019年，Sheng等将新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 的纳米抗体与辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP) 和会抒发，建立了一种竞争ELISA用于临床NDV抗体的检测[17]。Du等愚弄生物素化单域抗体建立了一种阻断ELISA检测猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV) 抗体[18]。Ma等愚弄PEDV N卵白纳米抗体建立了一种快速检测PEDV抗体的bELISA门径[19]。Ji等将NDV的纳米抗体以铁卵白和会的纳米抗体(Fenobody) 和纳米抗体和会的文告基因(RANbody) 的体式呈现，开拓了用于检测不一样品中NDV的夹心ELISA[20]。现在尚无PEDV S1卵白特异性单域抗体偏执在ELISA门径建立中的应用报谈。本课题组前期愚弄噬菌体展示期间筛选出针对PEDV S1卵白的单域抗体sdAb3，本接洽对sdAb3进行体外生物素标志，并愚弄生物素标志的sdAb3建立一种检测PEDV抗体的bELISA门径，以期为PED监测和免疫着力评估提供一个可靠门径。

1 材料与门径 1.1 主要试剂

单域抗体sdAb3是由本课题组前期愚弄噬菌体展示期间筛选的针对PEDV S1卵白的单域抗体，基因大小为339 bp。pET21b载体和pCANTAB-5E-sdAb3质粒由本实验室保存，大肠杆菌E. coli Trans5α克隆菌株、E. coli BL21(DE3)菌株和Ni-NTA Agarose购自TransGen Biotech，生物素灵通试剂盒购自广州易锦生物期间有限公司，HRP标志的链霉亲和素购自好意思国Thermo Fisher Scientific公司，PEDV抗体检测试剂盒购自加拿大Biovet公司。

1.2 引物筹商与合成

为了构建重组单域抗体sdAb3的抒发载体，凭据sdAb3基因序列筹商引物，在5′端引入BamHⅠ酶切位点，3′端引入Avitag短肽序列和Hind Ⅲ放浪性内切酶位点，由西安擎科泽西生物科技有限背负公司崇拜引物的合成，序列如下(斜体字辩别为放浪性内切酶位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，下划线处为Avitag标签)：pET21b-sdAb3-Avitag-F：FCGGGATCCGCAGGT CCAACTGCAGGAG；pET21b-sdAb3-Avitag-R：CCCAAGCTTTTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCGAAATATCGTTCAGACCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC。

1.3 重组单域抗体sdAb3原核抒发载体的构建

以pCANTAB-5E-sdAb3质粒为模板，进行sdAb3基因片断的扩增，愚弄相应的酶切位点将其连入原核抒发载体pET21b中，获取pET21b-sdAb3-Avitag质粒，测序正确后，用于下一步纯熟。

1.4 重组单域抗体sdAb3的抒发与纯化

将pET21b-sdAb3-Avitag质粒调整至E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中，挑取阳性克隆菌，接种于LB培养基中，于37 ℃恒温摇床中200 r/min漂流培养过夜，按照1︰100的比例接种于大的摇瓶中，培养至对数期，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行指引抒发，指引5 h后收菌。取1 mL指引后菌液于1.5 mL离心管中，12 000×g离心1 min收取菌液千里淀，加入100 μL 2×上样缓冲液，重悬菌体，置于开水中煮10 min，12 000×g离心10 min，取上清进行SDS-PAGE分析。对指引后的菌体进行超声破灭，138 kW超声3 s，暂停3 s，共超声40 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，收罗上清，千里淀用8 mol/L尿素熔解，辩别对上清和熔解的千里淀进行SDS-PAGE分析，进行sdAb3-Avitag卵白的可溶性分析。按照Ni-NTA卵白纯化试剂盒证实书进行重组卵白sdAb3-Avitag的纯化。

1.5 SdAb3-Avitag和会卵白的生物素标志

将纯化的sdAb3-Avitag和会卵白透析至10 mmol/L Tris (pH 8.0) 的缓冲液中，测定卵白浓度后对纳米抗体进行生物素标志，具体操作如下：Buffer A 8.3 μL，Buffer B 8.3 μL，sdAb3-Avitag 50 μg，BirA酶0.84 μL，ddH2O 34.3 μL，混匀后置于30 ℃恒温要求下响应30 min，响应完成后加入等体积的丙三醇，混匀后分装，定名为sdAb3-Biotin，放手-20 ℃保存。

1.6 SdAb3-Biotin活性分析

愚弄波折ELISA门径和Western blotting门径浮滑sdAb3-Biotin的生物学活性。波折ELISA门径：(1) 抗原包被。将截短的PEDV S1卵白(Asp，aa22-Pro，aa505) 和PEDV N卵白辩别包被于酶标板，100 ng/孔，置于4 ℃包被过夜。(2) 禁闭酶标板。将包被液弃去，用PBST洗板4次，200 µL/孔加入1% BSA，37 ℃恒温箱中禁闭1 h。(3) 加样。弃去禁闭液，用PBST洗板4次，将sdAb3-Biotin辩别按1︰100、1︰1 000、1︰2 000、1︰4 000和1︰8 000进行稀释，100 µL/孔加入酶标板中，37 ℃孵育2 h。(4) 孵育酶标抗体。弃去sdAb3-Biotin，用PBST洗板4次，以1︰5 000的比例稀释链霉亲和素-HRP抗体，100 µL/孔加入酶标板中，37 ℃恒温箱中孵育1 h。(5) 显色。弃掉酶标二抗，用PBST洗涤4次，100 µL/孔加入簇新配制的TMB显色底物，37 ℃恒温箱中避光孵育15 min。(6) 拒绝。50 µL/孔加入3 mol/L H2SO4拒绝显色响应，测定OD450。

Western blotting门径：将PEDV S1重组卵白进行SDS-PAGE后转印至PVDF膜上，转印后的PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，25 ℃孵育2 h；随后，将PVDF膜置于用1% BSA按1︰2 500稀释的sdAb3-Biotin中，25 ℃孵育1 h；用PBST洗涤后，对PVDF膜进行孵育于酶标二抗(按照1︰5 000的链霉亲和素-HRP)，25 ℃孵育1 h；弃去酶标二抗，用PBST洗涤后曝光，用凝胶成像系统拍照记载。

1.7 抗原包被量与sdAb3-Biotin稀释比例

愚弄棋盘法确信最适抗原包被量与sdAb3-Biotin稀释比例，操作经由如法子1.6，包被不同量的PEDV S1卵白，辩别为25 ng/孔、50 ng/孔、100 ng/孔和200 ng/孔，sdAb3-Biotin的稀释比例为：1︰500、1︰1 000、1︰2 000、1︰4 000、1︰6 000、1︰8 000和1︰10 000，确信出最适抗原包被量和sdAb3-Biotin的稀释比例。

1.8 最适血清稀释比例

弃取最适抗原包被量进行包被且禁闭后进行bELISA：对酶标板进行禁闭，弃去禁闭液，用PBST洗涤后，将PEDV阴阳性血清辩别按照1︰1、1︰5、1︰10、1︰20、1︰40和1︰80进行稀释后，100 µL/孔加入酶标板中，37 ℃孵育90 min，用PBST洗涤4次，加入最适比例稀释的sdAb3-Biotin，用PBST洗涤后，加入酶标二抗后进行显色，筹商各稀释比例阻断率。阻断率PI=(1–阳性血清OD450/阴性血清OD450)×100%，选取阻断率最高的稀释比例看成最适血清稀释比例。

1.9 最适血清孵育时候

弃取最适包被抗原和最适血清稀释比例的要求下，按照法子1.8进行bELISA，不同之处将血清辩别孵育30 min、60 min、90 min和120 min，筹商各组的阻断率，选取阻断率最高的组看成血清最适孵育时候。

1.10 SdAb3-Biotin最适孵育时候

弃取上述筛选要求进行SdAb3-Biotin的最适孵育时候摸索，将最适稀释比例的SdAb3-Biotin辩别孵育30 min、60 min、90 min和120 min，筹商各组的阻断率，阻断率最高的看成sdAb3-Biotin最适孵育时候。

1.11 最适链霉亲和素-HRP最好孵育时候

按照上述已确信的要求进行链霉亲和素-HRP的最适孵育时候的筛选，将链霉亲和素-HRP按照1︰5 000稀释后，辩别孵育30 min、60 min、90 min和120 min，筹商各组的阻断率，阻断率最高的孵育时候为链霉亲和素-HRP最适孵育时候。

1.12 bELISA临界值果然信

对90份PEDV阴性血清按照上述确信的各项最适要求进行bELISA，筹商90份阴性血清的阻断率，按照阻断率确信bELISA的临界值：临界值A=阴性血清平均PI值+2×标准差(s)；临界值B=阴性血清平均PI值+3×标准差(s)，筹商出临界值A与临界值B，若样品阻断率PI≥临界值B，则判定样品为PEDV抗体阳性；若临界值A＜PI＜临界值B，则判定为PEDV抗体可疑，需要对样品进行复检；若复检收尾仍为可疑，则判定样品为PEDV抗体阴性；若PI≤临界值A，则判定样品为PEDV抗体阴性。

1.13 重叠性纯熟

为考据bELISA门径的重叠性，选取不同东谈主员在不同期间按照上述bELISA操作经由对7份猪血清进行4次测试，每个样品进行3个重叠孔，对检测样品的阻断率进行统计分析来评估bELISA门径的重叠性。

1.14 特异性纯熟

为考据bELISA门径的特异性，愚弄建立的bELSIA门径对实验室保存的其他病原的阳性血清进行检测，包括TGEV、PRRSV、PCV、PRV、PPV和JEV的阳性血清，筹商检测样品的阻断率来评估bELISA门径的特异性。

1.15 妥当率纯熟

愚弄建立的bELISA门径和商品化PEDV抗体检测试剂盒辩别对54份血清样品进行检测，筹商两者的妥当率。

2 收尾与分析 2.1 重组单域抗体sdAb3的抒发与纯化

将构建的pET21b-sdAb3-Avitag调整至E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，愚弄终浓度为1 mmol/L的IPTG进行指引抒发，收尾如图 1A所示，与预期收尾一致，在约15 kDa处可见场所卵白。此外，sdAb3-Avitag重组卵白以原宥体的体式存在(图 1B)。用Ni-NTA进行纯化后，获取纯度较高的sdAb3-Avitag重组卵白(图 1C)。

2.2 SdAb3-Biotin活性分析

愚弄波折ELISA和Western blotting对sdAb3生物素标志着力进行了考据。Western blotting收尾表露，sdAb3-Biotin大要特异性地检测到S1重组卵白(图 2A)，波折ELISA收尾表露，当sdAb3-Biotin稀释到1︰8 000仍大要与S1卵白进行高超的响应(图 2B)，以上标明sdAb3-Biotin具有高超的活性。

2.3 抗原包被量与sdAb3-Biotin稀释比例

通过棋盘滴定法进行波折ELISA，收尾标明当S1卵白包被量为200 ng/孔、sdAb3-Biotin稀释比例为1︰8 000时，OD450约为1.0，故将此抗原包被量和sdAb3-Biotin抗体稀释比例看成最适包被量和抗体稀释比例(图 3)。

2.4 最适血清稀释比例

将阴阳性对照血清辩别按照1︰2、1︰5、1︰10、1︰20、1︰40和1︰80的比例进行稀释后用bELISA进行检测，收尾表露，血清在1︰2稀释的情况下具有最高的阻断率(图 4A)，故血清最适稀释比例为1︰2。

2.5 最适血清孵育时候

基于上述最适要求进行bELISA，摸索最适血清孵育时候，收尾表露，血清孵育120 min时具有最高的阻断率(图 4B)，故将此看成最适血清孵育时候。

2.6 SdAb3-Biotin最适孵育时候

基于上述最适要求进行bELISA，摸索最适sdAb3-Biotin孵育时候，收尾表露，孵育时候为30 min时具有最高的阻断率(图 4C)，故将此看成最适sdAb3-Biotin孵育时候。

2.7 酶标二抗最适孵育时候

基于上述最适要求进行bELISA摸索，最适链霉亲和素-HRP的孵育时候，收尾表露，链霉亲和素-HRP按照1︰5 000稀释，孵育时候为30 min时具有最高的阻断率(图 4D)，故将此看成酶标二抗最适孵育时候。

2.8 bELISA的临界值

对90份已知阴性血清进行了bELISA检测，90份阴性血清的平均PI为7.67%，标准差(s) 为8.98%，因此，当样品的PI≥35%，则判定样品为PEDV抗体阳性；若26%＜样品的PI＜35%，则判定为PEDV抗体可疑，需要进行再行检测，若再行检测收尾仍为可疑，则判定为PEDV抗体阴性；若样品PI≤26%，则判定为PEDV抗体阴性(图 5)。

2.9 bELSIA的重叠性

为考据bELISA门径的重叠性，选取不同东谈主员在不同期间按照上述bELISA操作经由，对7份猪血清进行4次测试，每个样品进行3个重叠孔，收尾标明，在4次重叠纯熟中，不同东谈主员检测归拢份血清样品的阴阳性收尾一致(图 6)，且CV%均在10%以下，标明该bELISA门径具有高超的重叠性。

视频在线看 2.10 bELISA特异性

愚弄建立的bELISA门径对TGEV、PRRSV、PCV、PRV、PPV和JEV阳性血清进行检测，收尾标明，除PEDV阳性对照血清，其余病原阳性均不与S1卵白进行麇集，从而不可阻断sdAb3-Biotin与S1卵白麇集。收尾标明该bELISA门径领路出高超的特异性(图 7)。

2.11 bELISA与商品化试剂盒妥当率

应用商品化试剂盒和本接洽建立的bELSIA辩别对54份临床猪血清进行检测，经筹商，二者的总体妥当率可达92.59% (表 1)。

3 商议

由于变异毒株的高流行性，PED已成为威迫寰宇养猪业的最紧要的疫病之一，早期快速的会诊对防控PEDV的传播极端紧要[21]。S卵白是PEDV的主要抗原之一，且含有多个抗原表位，是进行PEDV遗传变异分析和建立ELISA门径的主要靶卵白[22]。抗体在波折ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等不同体式的ELISA检测门径中起着紧要的作用。由于这些门径齐是基于PEDV特异性单克隆抗体或多克隆抗体，因此制备、纯化和标志抗体的过程复杂且崇高[23]。然而，纳米抗体的出现克服了这些问题，与传统的抗体比较，纳米抗体可在传统的原核抒发系统和酵母抒发系统中进行大量的抒发。笔者课题组前期报谈的基于PEDV N卵白纳米抗体建立的bELISA门径[19]和本接洽基于S1卵白纳米抗体建立的bELISA与商品化试剂盒的妥当率辩别是94%和92.56%，这可能与他们检测PEDV感染后不同期间段的抗体以及抗原的保守性关系。PEDV感染早期时，猪体内当先会产生大量针对N卵白的抗体，而针对S卵白的抗体抓续时候长于N卵白[5， 24]。此外，几种基于不同病毒纳米抗体建立的ELISA门径已被用于病毒血清学检测，包括NDV和SIV。

生物素-链霉亲和素体系是一种极端灵验的生物响应扩增体系，一个链霉亲和素不错特异性麇集4个生物素分子，起到放大信号的作用，从而普及响应的机灵度[25]。生物素-链霉亲和素体系由于其高特异性和强亲和力，已被庸俗应用于多样物资的检测。此外，生物素的分子量惟有244.31 Da，是HRP分子量的1/160[26]。因此，用生物素标志卵白时，卵白的生物活性基本不受影响。商酌到纳米抗体的分子量小，生物素标志不错最大界限地保留其结构和功能。以生物素化的sdAb5为基础，建立了一种特异性、敏锐性和重现性高超的检测猪血清中SIV抗体的ELISA门径。商酌到纳米体在会诊开拓中的应用日益加多，本接洽以S1卵白的特异性单域抗体sdAb3为基础建立了一种具有高超的特异性、机灵度、重叠性和低资本的bELISA门径，其中，sdAb3可通过原核抒发系统进行大量抒发，从而大要大幅度镌汰检测资本，有望用于临床执行中。

总之，本接洽通过对PEDV S1卵白的特异性单域抗体sdAb3进行生物素化标志，以生物素化sdAb3为基础建立了bELISA门径并对临床54份样品进行检测伪娘 拳交，检测收尾与商品化试剂盒检测收尾妥当率为92.56%。该bELISA门径具有高超的特异性、机灵性与重叠性，具有省时、低资本的上风，在坐蓐执行中具有较高的应用价值。本接洽为波折会诊PEDV的感染和监测猪群中PEDV疫苗免疫水平提供了一种新的门径。